本发明涉及家畜分子生物学检测领域，具体涉及一种基于qpcr技术检测黄牛sike1基因cnv标记的方法。
背景技术：
基因组dna作为生物携带遗传信息的载体，在个体表型形成中发挥着至关重要的作用，而基因组变异则是造成个体间或种间差异的主要遗传来源。分子育种即分子标记辅助选择(molecularmark-assistselection,mas)，该技术是借助dna分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜禽育种中，通过对与生长性状密切相关，并且与数量性状紧密关联的dna标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。
拷贝数变异(copynumbervariations,cnvs)是指基因组中大于50bp的片段插入、缺失、复制和复杂的重组的现象，是一种在基因组亚显微水平上的结构变异，可以通过剂量效应、位置效应、阻断功能基因、融合基因、暴露隐性等位基因和潜在的跃迁效应来影响基因的功能以及个体的表型。研究表明，有些cnv位点位于功能基因的内部，与畜禽的生长性状有相关关系，或与qtl位点重合，对经济性状有一定影响。
目前，cnv常用的检测方法主要分为两类：一类主要用于在全基因组范围内检测未知cnv，包括基因组芯片和高通量测序技术；另一类主要用于定点检测或验证已知cnv。
芯片方法主要包括比较基因组杂交芯片(comparativegenomichybridization,cgh)和snp芯片，在比较基因组芯片中寡核苷酸探针芯片因其具有高精度、高灵敏度、样本需要量小等特点，被广泛使用。snp芯片在检测时不需要对照样本，通过被检测样本内snp信号强度来进行分析，其主要优点是能同时提供拷贝数和基因型信息，还可以显示杂合性缺失。但是snp芯片上的探针在基因组分布不均衡，很多复杂区域探针设计困难。因此，snp芯片在检测cnv时有一定的局限性。随着新一代测序技术的成熟，直接通过重测序来检测基因组结构变异已经成为当前最有效的检测手段。与杂交技术相比，利用测序技术来检测cnv具备很多优势，如提高了cnv的分辨率、可以确定cnv的边界、可以检测出个体cnv的绝对拷贝数，对于结构变化复杂的cnv也有较高检测效力，但这种方法成本较高。
对于已确定的cnv的检测，通常是采用基于pcr技术和杂交技术的一些方法。例如qpcr、qmpsf、mlpa、fish、southernblotting和maph等。其中，实时荧光定量pcr(qpcr、qrt-pcr)最为常用。根据qpcr所使用的荧光化学方法的不同，主要分为荧光染料嵌入法和荧光杂交探针法两类。pcr反应体系中加入过量的sybrgreen染料分子，能特异性地渗入dna双链并发射荧光信号，而游离的染料分子则仅有很低的荧光本底，几乎不发光，从而确保信号的增加与pcr产物的增加同步，可通过检测荧光信号的强度来反映基因组dna的数量。通过对目的基因(具有拷贝数变异)及内参基因(无拷贝数变异)进行相对定量，根据2-δδct方法统计检测样本候选基因的拷贝数。
sike1(ikk抑制因子)是一种含有207个氨基酸残基的小卷曲螺旋结构域蛋白，在包括心脏在内的大多数组织中普遍存在。关于sike1基因的功能，相关研究表明ikk抑制因子可以作为一种干扰素通路的负调节因子。但目前尚未见关于牛sike1基因拷贝数变异对黄牛生长、泌乳性状影响的研究报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种sike1基因cnv标记辅助检测黄牛体尺性状的方法及其应用。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种检测黄牛sike1基因cnv标记的方法，包括以下步骤：
以提取自待测黄牛(例如，云岭牛)个体的血液全基因组dna为模板，以引物对p1以及引物对p2为引物，分别通过实时荧光定量pcr(qpcr)扩增sike1基因的拷贝数变异区域以及作为内参的btf3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定黄牛个体sike1基因的拷贝数变异类型。
优选的，所述的sike1基因的拷贝数变异区域位于牛sike1基因候选区域chr3:28561571-28565970(参考基因组序列nc_037330.1)。
优选的，所述的拷贝数变异类型是根据log22-δδct(即-δδct)将定量结果分为的三类：插入型，log22-δδct>0.5；缺失型，log22-δδct<-0.5；正常型，-0.5≤log22-δδct≤0.5。
优选的，所述的引物对p1为：
上游引物f1：5’-ttccacccaaagtgtggatgtt-3’
下游引物r1：5’-ctgcctcctgaatggaactgt-3’；
所述的引物对p2为：
上游引物f2：5’-aaccaggagaaactcgccaa-3’
下游引物r2：5’-ttcggtgaaatgccctctcg-3’。
优选的，所述的实时荧光定量pcr所用的扩增体系包括：50ng/μl模板dna1μl以及10μmol/l的引物对p1或引物对p2所对应的上、下游引物各0.5μl。
优选的，所述的实时荧光定量pcr所用的反应程序为：95℃预变性1min；95℃变性15s，60℃退火15s，共40个循环。
优选的，基于引物对p1扩增的pcr产物片段大小为125bp，基于引物对p2扩增的pcr产物片段大小为166bp。
上述检测黄牛sike1基因cnv标记的方法在黄牛分子标记辅助选择育种中的应用。
优选的，所述的待测黄牛(例如，云岭牛)群体中，具有缺失型拷贝数变异类型的个体在生长性状(例如，胸围、胸宽、胸深、尻长)上优于具有正常型、插入型拷贝数变异类型的个体。
本发明的有益效果体现在：
本发明利用基因组dna进行实时荧光定量pcr，以btf3基因为参照，根据-δδct值即可确定黄牛个体sike1基因的拷贝数变异的类型，并发现了该sike1基因的拷贝数变异可以作为分子标记。与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明提供的黄牛sike1基因拷贝数变异检测方法，不受年龄的限制，可用于早期选育，甚至在个体刚出生时就可进行选择；
(2)本发明快速、简单、成本低，能够准确可靠的鉴定黄牛个体sike1基因的拷贝数类型；
(3)本发明在一定程度上为黄牛生长性状的分子标记辅助选择提供科学依据，可快速建立种质资源优良的黄牛种群(例如，云岭牛种群)，从而加快育种过程。
附图说明
图1为本发明中进行qpcr(sike1基因)绘制的扩增曲线。
图2是本发明中进行qpcr(sike1基因)绘制的溶解曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，所述实施例是对本发明的解释，而不是对本发明保护范围的限制。
本发明利用qpcr对云岭牛sike1基因的拷贝数变异(牛sike1基因候选区域chr3:28561571-28565970)进行检测。
1、云岭牛样本采集
本发明中采集的云岭牛来自于云南省昆明市小哨乡草地动物科学研究院(采集时间：2018年10月)，共计173头，都为母牛，采集方法为颈静脉采血。并记录它们的生长性状数据，如体高、体重、体斜长、胸围、胸宽、胸深、尻长、坐骨端宽、十字部高等，以用于后续的关联分析。
2、血样基因组dna的分离、提取、纯化
参考文献sambrocketal(2002)方法。
3、目的基因及内参基因扩增
以ncbi数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的牛sike1基因(目的基因)序列(genbankaccessionno.nc_037330.1)为参考序列，利用primer5.0设计引物(引物对p1)扩增sike1基因拷贝数变异区域(chr3:28561571-28565970)中一段125bp序列，同时，以ncbi所公布的牛btf3基因序列(ac_000177.1)为参考序列，采用相同的方法设计扩增内参基因(btf3基因)中一段166bp的序列的引物(引物对p2)。引物对序列信息如表1所示(引物合成时间：2019年11月)。
表1.实时荧光定量pcr的引物信息
注：f表示上游引物，r表示下游引物。
进行qpcr所用的扩增体系以10μl计为：50ng/μl模板dna1μl，10μmol/l的上、下游引物各0.5μl，bioeasymastermix(sybrgreen,norox)5μl，及去离子水3μl。
pcr扩增的反应程序为：
(1)预变性：95℃1min；
(2)扩增反应：95℃变性15s，60℃退火15s，40个循环。
绘制溶解曲线：95℃10s，从65℃到95℃，+0.5℃5s。
通过绘制扩增曲线和溶解峰确定引物适用于qpcr分析。扩增曲线平滑，表明qpcr试剂质量好且扩增体系和条件合适(图1)；绘制的溶解曲线，各样品曲线吻合在一起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰，表明引物质量好(图2)。
4、拷贝数变异的推断
每个样品分别用目的基因序列和内参基因序列的引物(引物对p1和p2)进行扩增，并且每对引物3个重复。根据2-δδct方法进行拷贝数的分析。其中δδct＝(ct目的基因-ct内参基因)实验组-(ct目的基因-ct内参基因)对照组。实验组即为待检测有无cnvs的样本，对照组即为已知无拷贝数变异的样本，可以采用重测序试验中所选择的对照组黄牛(云岭牛)个体。2-δδct表示的是实验组目的序列的拷贝数相对于对照组的倍数，ct即cyclethreshold，为pcr扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。将基因的表达丰度进行对数转化(以2为底2-δδct的对数)使之符合正态分布，进行方差齐性检验后，统计检验各组间的差异。
当目的基因为正常型(median)序列时，根据log22-δδct计算出归一化值为0左右(log22-δδct≤|±0.5|)。当目的基因为缺失型(loss)序列时，log22-δδct<-0.5。当目的基因为插入型(gain)序列时，log22-δδct>0.5。
5.云岭牛sike1基因cnv位点与生长性状的关联分析
关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用spss23软件分析各基因型间的生产性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：
yijk＝μ+ai+cnvj+eijk，
其中：yijk为性状观察值，μ为总体均值，ai为第i头个体的年龄，cnvj为第j个拷贝数变异类型的固定效应，eijk为随机误差。各组数据间的差异采用lsd多重比较进行检验，试验结果以mean±se形式表示。数据处理结果见表2。
表2.云岭牛sike1基因拷贝数变异与生长性状的关联分析
注：表中所计算的数值代表平均值±标准误差；数值的右上角标有a、b代表同行数据间差异显著水平p＜0.05；数值的右上角标有a、b代表同行数据间差异为极显著水平p＜0.01。
关联分析结果表明(见表2)：云岭牛sike1基因cnv位点可显著影响胸围、胸宽、胸深和尻长，并且，优势拷贝数变异类型为缺失型，说明sike1基因cnv位点的缺失型可以作为一个提高云岭牛生长性状的候选分子遗传标记(cnv标记)，而对于母牛而言，胸围、胸宽、胸深也与提高泌乳性状相关。
6.上述cnv标记在黄牛选育中的应用
获得的候选分子遗传标记，可以用于寻找与其相关或紧密连锁的影响黄牛生长性状的数量性状基因座。还可以用于黄牛的分子标记辅助选择，即通过对黄牛sike1基因cnv位点拷贝数变异类型的检测，选择缺失型的个体留种并扩繁，从而能够加快黄牛品种(例如，云岭牛)改良的选育进程。
<110>西北农林科技大学
<120>一种sike1基因cnv标记辅助检测黄牛体尺性状的方法及其应用
<160>4
<210>1
<211>22
<212>dna
<213>人工合成
<400>1
ttccacccaaagtgtggatgtt22
<210>2
<211>21
<212>dna
<213>人工合成
<400>2
ctgcctcctgaatggaactgt21
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工合成
<400>3
aaccaggagaaactcgccaa20
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>人工合成
<400>4
ttcggtgaaatgccctctcg20